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HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書中文版

HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶aldose reductaseAR)活性光度法定量檢測試劑盒

產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

組織醛糖還原酶(aldose reductaseAR)活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過底物葡糖醛酸,在醛糖還原酶催化作用,產生山梨醇,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷NADPH)氧化后峰值的降低,即采用光度法來測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的其適用于各種組織(動物、人體、昆蟲等)裂解懸液樣品醛糖還原酶的活性檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定。

 HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書中文版

技術背景

 

醛糖還原酶(aldose reductaseALR2EC1.1.1.21是一種NADPH依賴性氧化還原酶,屬于醛酮還原酶(aldo-keto reductaseAKR)超級家族成員之一,催化各種醛類和羰基化合物的還原反應,特別是葡萄糖還原為山梨醇的反應,是葡萄糖代謝中多元醇(polyols)通路的**步反應的關鍵限速酶。醛糖還原酶主要在人體肝組織、晶狀體、視網膜、雪旺氏細胞、胎盤組織和紅細胞中表達。醛糖還原酶與糖尿病并發癥相關,包括白內障、神經病變、腎臟病變、視網膜病變、動脈粥樣硬化等,由此成為藥物靶標。基于底物葡糖醛酸(glucuronate),在醛糖還原酶催化作用,產生山梨醇sorbitol),同時其輔酶因子還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphateβ-NADPH)轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphateβ-NADP),通過測定吸光值的變化340nm 波長),來定量分析醛糖還原酶的活性。其反應系統為:

 

 ALR2

Glucuronate + β-NADPH → sorbitol + β-NADP

 

產品內容

 HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書中文版

清理液(Reagent A       60 毫升

裂解液(Reagent B  10毫升

緩沖液(Reagent C  20毫升

反應液(Reagent D   2毫升

底物液(Reagent E     2 毫升

陰性液(Reagent F   500 微升

產品說明書     1

 HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書中文版

保存方式

 

保存在-20℃冰箱里反應液(Reagent D)和底物液(Reagent E避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書中文版

1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

(微型)臺式離心機:用于樣品操作

比色皿或96孔板:用于光度的容器

分光光度儀或酶標儀:用于樣品光度分析

 

實驗步驟

 HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書中文版

實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液(Reagent B置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

一、 樣品準備HPBIO-JM9156組織醛糖還原酶(aldose reductase;AR)活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書中文版

 

1. 手術取出動物組織,并秤重以確定500毫克組織重量 

2. (選擇步驟)放進預冷的15毫升錐形離心管

3. (選擇步驟)加入3毫升清理液(Reagent A清洗1

4. 移入到一個液氮凍存管

5. 即刻放進液氮罐過夜

6. 次日從液氮罐里取出,即刻(*快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融

7. 放進一個15毫升錐形離心管

8. 加入預冷的500微升裂解液(Reagent B 

9. 轉移到預冷的1.5毫升離心管

10. 強力渦旋震蕩30秒,充分混勻

11. 置于冰槽里孵育30分鐘,期間每10分鐘強力渦旋震蕩30(注意:如需暫時停止,放進-70冰箱里儲存備用

12. 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

13. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

14. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒

15. 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、 測定準備

 

1. 開啟并設定好分光光度儀(溫度為25℃):波長340nm,間隔2分鐘,讀數6次(共10分鐘),并置零

2. 從-20℃冰箱里取出試劑置于冰槽里融化;底物液(Reagent E避免光照

3. 緩沖液(Reagent C室溫下均衡溫度

 

三、 背景對照測定

 

1. 移取750微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入100微升反應液(Reagent D

3. 加入100微升底物液(Reagent E

4. 上下傾倒數次,混勻

5. 25℃溫度下孵育3分鐘

6. 加入50微升陰性液(Reagent F

7. 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照(0分鐘讀數-10分鐘讀數)

 

四、 樣品測定

 

1. 移取750微升緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入100微升反應液(Reagent D

3. 加入100微升底物液(Reagent E

4. 上下傾倒數次,混勻

5. 25℃溫度下孵育3分鐘

6. 加入50微升待測樣品(50微克蛋白)(注意:樣品須清澈

7. 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

8. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(0分鐘讀數-10分鐘讀數)

 

五、計算樣品活性

 

[(樣品讀數-背景讀數)X樣品稀釋倍數X 1體系容量;毫升)]÷[0.05(樣品容量毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數)X 1光徑距離;厘米)X 10(反應時間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 

 

單位=微摩爾NADPH/分鐘

 

六、 酶標儀測定

 

1. 96孔板上做好相應標記:背景對照和樣品

2. 分別移取150微升緩沖液(Reagent C96孔板

3. 分別加入20微升反應液(Reagent D

4. 分別加入20微升底物液(Reagent E

5. 輕輕搖動96孔板

6. 25℃溫度下孵育3分鐘

7. 分別加入10微升陰性液(Reagent F待測樣品(20微克蛋白)到相應孔(注意:樣品須清澈

8. 輕輕搖動96孔板

9. 即刻放進酶標儀檢測:獲得0分鐘和10分鐘讀數

10. 活性計算

 

[(樣品讀數-背景讀數)X樣品稀釋倍數X 0.20體系容量;毫升)]÷[0.01(樣品容量毫升)X 6.22(毫摩爾吸光系數)X 0.6光徑距離;厘米)X 10(反應時間;分鐘)]=單位/毫升÷(樣品蛋白濃度)毫克/毫升=單位/毫克 

 

單位=微摩爾NADPH/分鐘

 

注意事項

 

1. 本產品為20次(比色皿)和100次(96孔板)操作,包括背景對照

2. 操作時,須戴手套

3. 系統操作過程中,背景測定只需1

4. 樣品須澄清,至關重要 

5. 孵育完成后即刻光度測定

6. 測定值由變化;測定持續10分鐘

7. 樣本測定10分鐘讀數0分鐘讀數表明具有酶活性

8. 光度測定后,比色皿須清洗徹底

9. 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升(本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒)

10. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度

11. 醛糖還原酶單位活性定義為:在25℃,pH 6.2條件下,每分鐘內能夠轉化1微摩爾葡糖醛酸山梨醇所需的酶量作為一個活性單位

12. 本公司提供系列醫學生化經典分析試劑產品

 

質量標準

 

1. 本產品經鑒定性能穩定

2. 本產品經鑒定檢測敏感

 

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