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HEPENGBIO 植物氧化應激活性氧魯米諾化學發光法定量檢測試劑盒 產品說明書

HEPENGBIO  植物氧化應激活性氧魯米諾化學發光法定量檢測試劑盒 產品說明書
(中文版)
主要用途
HEPENGBIO 植物氧化應激活性氧(ROS)魯米諾化學發光法定量檢測試劑是一種旨在通過自由基探針魯
米諾和強化劑的參與下,植物樣品中的活性氧族使發光物氧化降解并發光,在化學發光儀(Luminometer)
的幫助下定量檢測樣品中活性氧族(過氧化氫)的生成和數量的權威而經典的技術方法。該技術經過精心
研制、成功實驗證明的。其適用于各種新鮮的植物組織(葉片、谷粒、種子等)等的活性氧族的檢測。可
以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老和代謝等的研究。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡易,性能穩定,
檢測敏感。
技術背景                  HEPENGBIO  植物氧化應激活性氧魯米諾化學發光法定量檢測試劑盒 產品說明書
超氧自由基陰離子(superoxide radical;O 2 - )、過氧化氫(hydrogen peroxide;H 2 O 2 )、羥自由基或氫氧基
(hydroxyl radical;OH - )、過氧化基(peroxyl radical;ROO - )、氫過氧自由基(hydroperoxyl;HOO)、烷氧
自由基(alcoxyl radical)、氮氧基(nitric Oxide;NO - )、過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion;ONOO - )
次氯酸(hypochlorous acid;HOCl)、半醌自由基(semiquinone radical)、單線態氧氣(singlet oxygen)等
細胞內活性氧族(Reactive Oxygen Species;ROS)的產生和增多,將導致細胞衰老或凋亡,甚而導致植物
氣孔關閉(stomatal closure)和根毛發育(root hair)異常等病理狀況。魯米諾(luminol),又稱氨基鄰苯二
甲酰肼(luminol;3-aminophthalic hydrazide 5-amino-2,3-dihvdro- 1,4-phthalazinedione),是一種脂溶性的發
光劑,氧化后生成魯米諾自由基而化學發光,具有460nm左右峰值的帶狀光譜,肉眼可觀察到鮮明的紫藍
色。魯米諾以單價氧化形式與超氧自由基陰離子反應,產生不穩定性內過氧化物或二氧環丁烷(Dioxetane),
由此分解成電激發狀態,通過釋放光子,回復到基態。魯米諾作為探針,可以檢測植物中過氧化氫、超氧
自由基陰離子和羥自由基,其中過氧化氫*強,其發光強度與過氧化氫水平成正相關。
產品內容
HEPENGBIO 清理液(Reagent A) 毫升
HEPENGBIO 強化液(Reagent B) 毫升
HEPENGBIO 發光液(Reagent C) 毫升
產品說明書 1 份
保存方式                     HEPENGBIO  植物氧化應激活性氧魯米諾化學發光法定量檢測試劑盒 產品說明書
保存 HEPENGBIO 強化液(Reagent B)和 HEPENGBIO 發光液(Reagent C)在-20℃冰箱里,嚴格避免
光照;其余的保存在 4℃冰箱里;有效保證 6 月
用戶自備
2                      HEPENGBIO  植物氧化應激活性氧魯米諾化學發光法定量檢測試劑盒 產品說明書
15 毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器
1.5 毫升離心管:用于樣品操作的容器
微型臺式離心機:用于去除樣品雜質
DOUNCE 勻漿器:用于裂解植物組織樣品
超聲儀:用于裂解植物組織樣品
測試管或黑色 96 孔板:用于發光檢測用的容器
化學發光儀:用于檢測化學發光
實驗步驟
一、  樣品預處理
1. 準備好新鮮的植物組織(葉片、谷粒、種子等),并秤重以確定 500 毫克組織重量
2. (選擇步驟)放進預冷的 15 毫升錐形離心管
3. (選擇步驟)加入 xx 毫升 HEPENGBIO  清理液(Reagent A )清洗 1 次
4. 即刻用刀片切碎組織
5. 放進一個預冷的 15 毫升錐形離心管
6. 加入預冷的 xx 毫升 HEPENGBIO  清理液(Reagent A )
7. 渦旋震蕩 5 秒,充分混勻
8. 即刻放進預冷的 DOUNCE 勻漿器,在冰槽里用研磨棒勻化組織(約 80 下)
9. 將所有組織勻漿物移入 1.5 毫升離心管
10.強力渦旋震蕩 5 秒,充分混勻
11.(選擇步驟)在冰槽里,置于 200 瓦超聲儀下,功率 50%,猝擊 5 秒
12.放進 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘,速度為 5000g(或 7500RPM,例如 eppendorf 5415)
13.小心移出上清液(注意: 不要觸碰沉淀物 )到另一個新的預冷的 1.5 毫升離心管
14.(選擇步驟)如果上清液含有肉眼可見的殘渣,重復離心 5 分鐘一次,速度為 5000g(或 7500RPM,
例如 eppendorf 5415)
15.(選擇步驟)移取 5 微升進行蛋白定量測定,并調整蛋白濃度為 20 毫克/毫升(注意: 建議使用
HEPENGBIO Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒- HEPENGBIO30030.1)
16.置于冰槽里繼續后續操作(1 小時內)
二、  測讀         HEPENGBIO  植物氧化應激活性氧魯米諾化學發光法定量檢測試劑盒 產品說明書
測讀開始前,打開化學發光儀,設定儀器內溫度為 37℃預熱和整合測讀 10 秒或 15 分鐘;然后關掉實驗室
的燈光。將-20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化,嚴格置于暗室里。然后進行下列操作。
1. 準備好測試管,做好標記:陰性對照、樣品本底和樣品活性
2. 移取 xx 微升 HEPENGBIO  清理液(Reagent A )到陰性對照測試管
3. 移取 400 微升上述預處理的待測樣品到樣品本底測試管
4. 移取 400 微升上述預處理的待測樣品到樣品活性測試管
5. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO  強化液(Reagent B )到上述測試管,除樣品本底測試管外
6. 分別加入 xx 微升 HEPENGBIO  發光液(Reagent C )到上述測試管,除樣品本底測試管外
7. 輕輕渦旋混勻
8. 即刻放進 37℃化學發光儀里測讀
3
9. 整合測讀 10 秒,獲得相對發光單位(relative light unit;RLU)
10.或者整合測讀 15 分鐘,獲得光電子讀數:X 10 6 CPM(counted photon per minute)(注意:可以使用液
體閃爍儀替代)
11.計算 ROS 水平:
注意事項
1. 本產品為 50 次操作
2. 操作時,須戴手套
3. 測試前,樣品須新鮮收集,1 小時內為*佳
4. 樣品制備后即刻測讀,不宜過夜保存
5. 必要時,例如活性氧族過低,可以濃縮樣品處理
6. 如果測定體系變化,則試劑用量相應變化
7. 系統操作過程中,陰性對照只需測定一次
8. 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
9. 如果是注射式化學發光儀,建議測試前后使用無離子水沖洗化學發光儀注射(injector)管道
10.本公司提供系列活性氧分析試劑產品
質量標準
1. 本產品經鑒定性能穩定

2. 本產品經鑒定檢測敏感

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